Nella Sala 3, che è le ex chiesa del Gesù e dove è da ammirare il soffitto a cassettoni istoriati eseguito da Michelangelo Leggi nel 1536, sono esposti capolavori della pittura italiana del XV secolo, tra i quali:
MADONNA COL BAMBINO di scuola senese della prima metà del sec. XIV, pregevolissimo dipinto su tavola, proveniente dalla prima chiesa di S. Margherita.
CROCE DIPINTA (1320?) su tavola, ritenuta unanimemente opera giovanile di Pietro Lorenzetti, artista definito cortonese per le molte opere qui eseguite.
POLITTICO DEL SASSETTA. È l'ultima opera di scuola senese esistente nel museo. Dipinto su tavola intorno al 1435 raffigura la Madonna con il Bambino e quattro santi a rilievo in uno sfondo dorato. Notevoli i colori delle vesti ed il ricco paludamento di San Nicola, il primo santo a sinistra. Proviene dalla chiesa di San Domenico.
POLITTICO DELL'ANGELICO. Questa Madonna, con il Bambino sulle ginocchia e seduta in un trono ricoperto da un drappo prezioso su uno sfondo d'oro dalla cui profondità emergono figure di Angeli, completata lateralmente da quattro figure di Santi, ed in alto da una "Annunciazione" ed una "Crocefissione", mentre in basso in una predella è descritta la vita di San Domenico, apre il ciclo del Beato Angelico (Fra Giovanni da Fiesole 1395?-1455) che si estrinseca in una raffigurazione ieratica che suscita emozioni per la linea ed i colori. Proviene dalla chiesa di San Domenico.
ANNUNCIAZIONE DELL'ANGELICO. Il visitatore è ora di fronte ad una delle più belle tavole della pittura italiana, e potrà di per sé gustare lo squisito atteggiamento delle due figure, quella della Madonna e quella dell'Angelo nelle loro preziose vesti. Da ammirare l'architettura del porticato ed i particolari del giardino fiorito sullo sfondo del quale si allontanano dolenti Adamo ed Eva. Sulla predella una descrizione della vita della Vergine che desta ammirazione per la ricchezza dei particolari miniati e per la luminosità del paesaggio. Proviene dalla chiesa di San Domenico.
LA VERGINE DONA LA CINTOLA A SAN TOMMASO. Questa tela, recuperata da un recente restauro, è un capolavoro di Fra Bartolomeo detto poi della Gatta, frate camaldolese, e fu dipinta intorno al 1475 per la chiesa delle Contesse, da dove appunto proviene. Sono da ammirare i volti degli apostoli, vecchi, nobili, scarni o patetici immersi tutti in una profonda e sentita meditazione ed abbagliati dalla luce che emana dalla Vergine che prima di scomparire tra cori di angeli dona la sua cintola a San Tommaso.

La Sala 4 contiene le opere del Signorelli e della sua scuola. Luca Signorelli, nato a Cortona circa il 1455 e qui morto nel 1523, è uno dei pittori più significativi del Rinascimento italiano. I suoi nudi anticipano Michelangelo mentre i suoi paesaggi riecheggiano le ritmiche composizioni del Perugino.
COMPIANTO SUL CRISTO MORTO. Nella staticità delle figure, viste in un momento di sospesa e bloccata drammaticità, sono forti i legami con le sacre manifestazioni popolari. Al nudo del Cristo è collegato il racconto del Vasari che ne fa il ritratto del figlio morto di peste nel 1502. Il quadro venne dipinto nel 1502 per l'altare maggiore della chiesa di Santa Margherita.
COMUNIONE DEGLI APOSTOLI. È un dipinto datato 1512 e va messo a confronto con il precedente per coglierne la diversa maturazione del Signorelli come uomo e come artista. In essa c'è uno sforzo per uscire dal modo tragico e crudo di dipingere raffigurato dal Giudizio di Orvieto e dal Compianto di Cortona per imitare i toni dolci e le architetture ariose e ricamate di Raffaello e della nuova scuola cinquecentesca che improntava allora tutta la pittura. Stupenda è la figura di Giuda che nasconde l'ostia nella nera borsa a tracolla e si volge verso l'esterno del dipinto, esprimendo con lo sguardo la consapevolezza dolorosa del suo tradimento. Venne dipinto per l'altare maggiore della chiesa del Gesù.
Dopo questa opera l'intervento del maestro sulle opere successivamente dipinte e qui collocate si fa sempre più raro. Il pittore comincia a risentire considerevolmente del diminuire della sua reputazione artistica ed inizia in lui una crisi oltre che della sua arte anche dell'uomo. La crisi condiziona tutta la sua ultima attività. Sopraffatto dal mutare dei modi della pittura dopo i grandi rinnovamenti artistici dell'inizio del cinquecento e della dominante figura di Raffaello, lascia in gran parte l'esecuzione delle opere, che continuano in gran numero ad essergli affidate, alla mano degli aiuti della sua bottega in Cortona, in particolare a quella del nipote Francesco, pur predominando nelle stesse con la sua personalità.

Dalla Sala 5, attraverso lo Scalone dove sono esposti i cartoni della via crucis del cortonese Gino Severini (1883-1966), si accede alla Sala 6 che è l'Oratorio della ex chiesa del Gesù con le pareti affrescate da Cristofano Gherardi scolaro del Vasari. Gli affreschi rappresentano dodici sacrifici biblici mentre i riquadri della volta rappresentano, al centro la Trasfigurazione, ai lati la discesa al limbo e la conversione di San Paolo. Nella Sala 7 sono da ammirarsi:
CALICE CASALI, stupendo pezzo di oreficeria senese del XIV secolo firmato da Michele di Tommè e proveniente dalla vecchia chiesa di Santa Margherita.
RELIQUIARIO VAGNUCCI. Opera di Giusto da Firenze orefice fiorentino del XV secolo, fu regalato al Capitolo della Cattedrale dal cortonese Iacopo Vagnucci (1415-1487) segretario del papa Niccolò V e vescovo di Perugia.

Nella Sala 8 è custodito il PARATO PASSERINI. Questo stupendo parato da cerimonia pontificale composto di tredici pezzi di broccato in velluto cremisi, venne ordinato ad una manifattura fiorentina tra il 1517 ed il 1526 dal cortonese cardinale Silvio Passerini (1470-1529). L'opera puo' dare l'idea di quale grado di perfezione tecnica ed artistica avessero raggiunto le manifatture fiorentine che confezionavano all'epoca tessuti per l'abbigliamento dei sovrani di tutte le corti europee, dei loro dignitari e dei loro palazzi. Il disegno del tessuto si ripete con tronchi d'albero che danno origine a delle maglie all'interno delle quali è posto il bue giacente dello stemma cardinalizio del Passerini e, nei punti di tangenza, l'anello con il diamante dei Medici. I disegni sono dovuti ad Andrea del Sarto ed a Raffaellino del Garbo. E' ammirevole sul cappuccio del piviale il quadro della Trasfigurazione. Solenne lo stemma del cardinale nel paliotto.

Nella Sala 9 sono custodite tre tele: L'Immacolata, un dipinto di scuola raffaellesca della fine del cinquecento di non identificata provenienza, l'Estasi di Santa Margherita, dipinto nel 1701 da Giuseppe Maria Crespi (1665 -1747) e proveniente dalla cappella Venuti di Santa Maria Nuova ed il Miracolo di Sant'Antonio da Padova di scuola veneziana del Piazzetta dipinto nel 1750 da Francesco Capella (1711-1774) e proveniente dalla chiesa di San Filippo.